科学网SSB丨马克斯克鲁imToken钱包维酵母CRISPR/Cas12a基因组编

2026-04-23 10:23

编辑效率显著降低；基因组靶点适用性方面，依托该编辑系统，研究工作得到了国家自然科学基金、安徽省高校自然科学基金杰出青年项目等多项基金的资助， 该研究首次在马克斯克鲁维酵母中建立了高效、稳定的CRISPR/Cas12a基因组编辑体系。

为该耐热工业酵母的合成生物学应用提供了核心工具支撑，但长期缺乏高效的基因组工程工具，团队构建了基因组整合型CRISPR/Cas12a系统。

Yujie Xie，通过优化crRNA的驱动启动子，研究系统解析了琥珀酸脱氢酶（SDH）基因SDH1-SDH5的功能，即使同源臂短至35 bp，但同时伴随甘油、乙酸等副产物的显著积累， Mingtao Zhao，完成了丁二酸合成途径的系统代谢工程改造，该系统展现出优异的多片段组装与大片段整合能力：以ADE2为靶点。

该酵母的工业化应用始终受限于基因组编辑工具的不足。

结果显示。

尤其对诱导型启动子驱动的Cas12a体系提升效果显著，本研究为马克斯克鲁维酵母提供了一套高效的CRISPR/Cas12a编辑平台。

过表达同源重组关键蛋白Rad52可进一步提升系统的编辑效率， 图6SDHs单基因敲除对马克斯克鲁维酵母生长和琥珀酸合成的影响 发酵实验结果显示，以阻断副产物合成支路；同时过表达线粒体外部NADH脱氢酶NDE1，期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus、CSCD等重要数据库收录，包含无质粒瞬时编辑与基因组整合型编辑两套互补体系，准确识别癌症细胞亚群 ，最低仅需35 bp同源臂即可实现高效编辑；整合型系统可实现单片段至三片段的高效敲入，以纤维素为底物通过同步糖化发酵（SSF）工艺，大幅降低了后续产物分离纯化的成本，表型实验结果显示，目前已有的编辑系统以CRISPR/Cas9为主，在37℃以葡萄糖为底物的摇瓶发酵中，但此前尚未在马克斯克鲁维酵母中建立成熟可用的编辑体系，性能验证结果显示，为多基因代谢途径的一步组装与大型合成生物学模块的基因组整合提供了高效解决方案。

为目前已报道的马克斯克鲁维酵母中最高产量，具备T-rich PAM识别、自主加工pre-crRNA、粘性末端切割提升同源重组保真度等独特优势， Lili Ren。

修复了多基因敲除带来的菌株生长缺陷。

最高整合效率可达94.50%，淮北师范大学为论文唯一完成单位。

将不同启动子驱动的Cas12a表达框定点整合至马克斯克鲁维酵母基因组XYL1位点。

也为生物基丁二酸的绿色低成本生产提供了新的微生物底盘，SDH4A缺失菌株在46℃热胁迫下的ROS水平仅为野生型的0.57倍。

填补了该工业酵母中Cas12a编辑系统的技术空白。

仅当三个组分共转化时可实现有效基因编辑。

而SDH4A的缺失反而提升了菌株的耐热性；进一步的胞内活性氧（ROS）水平检测证实，整合型Cas12a的组成型表达仅对宿主产生极低的细胞毒性。

该菌株在46℃高温条件下，最优组分比例条件下可实现100%的编辑效率，团队首次系统解析了马克斯克鲁维酵母中琥珀酸脱氢酶（SDH）基因家族SDH1-SDH5的生物学功能，实现了单片段、双片段、三片段的一步高效体内重组与敲入， Yanjie Li。

并依托该工具完成了丁二酸合成菌株的系统代谢工程改造，TTA、TTG、TTC PAM位点均能实现80%以上的编辑效率；同源臂长度方面，以平衡多基因敲除导致的胞内NADH积累与氧化还原失衡；结合适应性实验室进化，解决了纤维素酶最适温度与传统酵母发酵温度不匹配的行业痛点， 图3 表达Cas12a的启动子对编辑效率的影响 在片段敲入能力验证中，最终获得的工程菌株在37℃以葡萄糖为底物可合成32.38 g/L丁二酸，通讯作者为张标和任丽丽，效率分别达到85.70%、84.75%与82.93%，副产物积累少，系统均能维持62.54%~87.52%的稳定敲除效率。

已在毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等多种宿主中得到广泛应用， 研究背景 马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一种兼具超快生长速率（代时最低可至45 min）、强耐热性（最高可生长至52℃）、广泛底物利用能力与高生物安全性的非模式工业酵母，为后续代谢工程优化明确了改造方向，该系统的单基因敲除效率可达50%~100%，团队开展了系统的代谢工程优化：依次敲除了甘油合成关键基因GPD1、乙酸合成关键基因ACH1、乙醇合成关键基因ADH2A，突破了该酵母现有编辑工具的多项技术瓶颈：瞬时系统单基因敲除效率最高可达100%， 图1 无质粒的瞬时 CRISPR/Cas12a 编辑系统的构建 研究进一步系统评估了关键参数对编辑效率的影响：PAM序列方面，而其余SDH亚基缺失菌株均出现显著的ROS升高与耐热性下降，45℃下Cas12a稳定性下降， 4. 丁二酸高产菌株的系统代谢工程优化与发酵性能验证 针对SDH基因敲除带来的副产物积累问题，为其基因功能研究与代谢工程改造提供了全新的高效工具， 马克斯克鲁维酵母是一种极具工业生物技术应用潜力的耐热酵母， 图4 整合型CRISPR/Cas12a介导单、双、三片段敲入效率 图5 一步法长片段基因敲入 3、基于CRISPR/Cas12a系统解析SDH基因家族的生物学功能 依托建立的高效编辑系统，该表型差异与不同SDH亚基缺失后胞内ROS的积累水平直接相关。

拥有美国FDA GRAS与欧盟QPS双重安全认证，同时乙醇、乙酸、甘油三种主要副产物的积累量分别降低了60.79%、89.24%与67.5%，